somatic mutation과 germline mutation

somatic mutation(체세포 돌연변이)과 germline mutation(생식세포 돌연변이)의 개념이 가장 많이 등장하는 곳은 암 유전체일 것이다. 

두 돌연변이 모두 DNA 서열상에서의 돌연변이를 가리키며 각각의 개념의 정의는 아래와 같다.

체세포 돌연변이 - 체세포에서 돌연변이가 발생. 몸 전체에서 일부 영역의 세포만이 돌연변이를 갖는다. 

생식세포 돌연변이 - 생식세포 돌연변이는 부모 세대로부터 물려받은, 배아가 형성될 때부터 이미 가지고 있는 돌연변이로서 몸 전체 어느 세포든지 같은 돌연변이를 갖는다.

두 돌연변이가 암 유전체에서 많이 등장하는 이유와 구분하는 방법은 무엇일까

대부분 암은 체세포 돌연변이로 발생한다. 사람이 살아가는 동안 ROS, UV 등으로 DNA가 계속 변이의 위험에 노출되는데 이때 세포 성장이나 세포 주기에 관여하는 유전자에 돌연변이가 생기면 암세포로 변이되는 것이 가장 일반적인 암 발생 패턴이다. 그런데 이러한 유전자에 생식세포 때부터 돌연변이가 있다면 애초에 사산될 확률이 높기 때문이다.

따라서 암 치료 시 환자 개개인의 암세포를 채취해서 생식세포 돌연변이보다는 체새포 돌연변이를 찾아내고 해당 변이에 맞는 약물을 투여하는 것이 개인 맞춤형 치료이다.

물론 BRCA 돌연변이같이 유전되는 생식세포 돌연변이도 존재한다. 이러한 암을 대략 5~20% 정도로 예상하고 있다.

두 돌연변이를 구분할 수 있는 가장 확실한 방법은 N-T pair 비교이다.

환자의 정상 세포와 암세포를 각각 채취하여 GATK에서 제공하는 Mutact2 또는 이 같은 목적의 프로그램을 돌리는 것이다.

이론적으로 염색체의 염기 서열은 Homozygous인지 Heterozygous인지에 따라 0%, 50%, 100%를 가지게 된다. 

ex) G/G or G/T or T/T 이런식으로 maternal, paternal을 가진다. 

하지만 체세포 변이가 일어나면 그 비율이 달라질 수 있다. 특정 염색체에서만 변이가 일어나거나 CNV 등이 일어나서 염기 비율이 달라진 세포와 일반적인 세포가 섞여있기 때문이다. 10개의 세포중에 7개의 정상세포가 T/T를 가지고 있었고 3개가 암세포이고 G/T로 변이되었다고 하자. G/T의 비율은 3/17가 된다. 

프로그램은 정상 세포에서 발견한 돌연변이와 암세포에서 발견한 돌연변이를 고려하여 체세포 돌연변이로 구분하게 된다.

Whole genome sequencing을 사용하여 염색체 전체에서 수행하는 것이 가장 확실하지만, 비용과 시간의 문제로 인해 Whole exome sequencing으로도 많이 진행하고 있으며 RNA-seq으로도 진행할 수 있지만 신뢰도가 그리 높지는 않다. 신뢰도가 높지 않은 이유는 RNA는 기본적으로 불안전 할 뿐만 아니라 RNA editing등으로 서열이 쉽게 변하고 이것이 변이라고 분석되어 질 수 있기 때문이다.

Reference -

http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/33-meiosis/somatic-vs-germline-mutatio.html

Cancer cell line 정보 받기

https://cancer.sanger.ac.uk/cell_lines

Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC) 홈페이지에서 cancer cell line에 대한 정보를 받는 법을 알아보려고 한다. 특히나 특정 cancer cell line으로 실험을 하였을 때 결과가 제대로 나왔는지 확인하기 위해 해당 cell line에 존재하는 variant를 검사해 볼 수 있다.

가장 먼저 홈페이지에서 genome version을 설정해주어야 한다. 이 후의 자료들은 다 위의 genome version을 기반으로 제공된다.

옆에 검색창에 "HeLa"를 검색해보자.

비슷한 이름의 다른 정보가 하나도 없기 때문에 Samples에 하나 나온다. 나머지 정보는 뻔한 것들이니 넘어가고 뒷부분에 존재하는 variants를 보면 HeLa가 가지고 있는 variants가 보인다.

Filters를 사용하면 더 specific한 변이들만 따로 고를 수 있다.

Reference - 

https://cancer.sanger.ac.uk/cell_lines

Clinical Cancer 데이터베이스

CIViC는 Clinical Interpretation of Variants in Cancer의 약자로 암을 유발할 수 있는 유전체 내의 변이를 모은 데이터 베이스이다. 

CIViC의 목적은 암 환자의 가진 변이중에 pathogenic한 변이를 찾아내고 여기에 맞는 치료방법을 사용하는 정밀의학에 적용하기 위한 데이터베이스 구축이며 유사한 목적을 가진 데이터베이스보다 더 적극적인 방식으로 정보를 제공하며 토론을 장려한다고 밝히고 있다.

그래서 아래처럼 데이터 베이스의 통계를 주마다 갱신하여 보여주거나, Activity를 업데이트하여 실시간으로 정보가 더 쌓여가는 것을 홈페이지 시작 화면에서 보여주고 있다.

아래는 TP53에서 찾은 변이의 결과로 CIViC에서는 해당 변이에 대해 진행된 연구를 표시하고 있는데 해당 변이를 치료할 때 사용할 수 있는 DRUG를 표시해 주고 있으며 evidence level을 A,B,C,D 총 네 단계로 나누어 어떤 evidence가 서포트 해주고 있는지도 표시하고 있다.

OncoKB 데이터베이스

source -

https://civicdb.org/home

https://www.nature.com/articles/ng.3774

http://oncokb.org/#/

Molecular disease

겸형 적혈구 빈혈증은 1977년 β-globin 유전자의 손상에 의해 일어나는 최초의 분자 질환으로 기록되었으며 이 후로 유전자의 손상이 질병과 연관되어 있다는 것이 알려졌다. 이후 NGS의 발달로 sequencing 가격이 저렴해지면서 single nucleotide level의 mutation까지 측정할 수 있게 되었고 특정한 유전자 염기의 변이가 질병과 관련 있다는 연구가 진행되기 시작했다.

하지만 질병이 생길 수 있는 요인을 매우 다양하기 때문에 특정 변이와 질병관의 관계성을 특정짓기가 쉽지 않아 미국의학유전학회(American Medical College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)는 이를 다섯가지 단계로 분류하기로 하였다.

Pathogenic

- 이미 신뢰할만한 데이터가 해당 변이와 질병간의 관계를 뒷받침 하고 있는 연구결과가 존재할 때 

Likely pathogenic

- 이전에는 보고되지 않았지만 질병과 연관되어 있는 유전자의 단백질 구조에 영향을 주는 변이가 발견되었을 때

Uncertain significance

- 이전에는 보고되지 않았고 다른 포유동물에서 해당 아미노산이 보존되어 있지만 변이가 발견되었을 때 

Likely benign

- 해당 변이가 이 전에 발견되었으며 in silico 실험 결과 영향력이 크지 않을 때

Benign

- 잦은 빈도로 변이가 발견되며 in silico 분석 결과 큰 영향이 없으며 또한 해당 변이를 친족이 가지고 있으나 같은 질병에 대해서 아무런 징후가 없을 때

위의 표기 방법을 따르는 것은 강제적인 것은 아니나 일반적으로 널리 쓰이는 방법이니 알아두는 것이 좋다.

source -

https://en.wikipedia.org/wiki/Variant_of_uncertain_significance#Classification

Sue Richards, PhD et al., Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology, Genetics in Medicine, 2015

암 분류법

암의 정의

- 암은 세포 주기 조절이 되지 않고 계속 세포 분열을 하는 질병의 통칭이다. 정상적인 세포는 일정한 주기를 가지고 분열하며 특정 조건이 만족되거나 한계 이상으로는 분열하지 않지만 암을 계속해서 분열하기 때문에 정상적인 기능을 하는 세포에 비해 수가 많으며 몸의 밸런스를 무너뜨리게 된다.

- 악성 종양이라고도 불리는데 양성 종양과는 구분을 해야한다. 일반적으로 종양은 비 정상적인 세포 덩어리를 의미하며 다른 조직으로 전이가 일어나면 악성 종양 그렇지 않으면 양성 종양이라고 부른다. 양성 종양은 발견시 제거하면 재발 위험이 낮지만 악성 종양은 이미 다른 조직으로 전이 했다면 찾기가 굉장히 어렵기 때문에 재발 위험이 높다.

- WHO에 의하면 neoplasm은 크게 4개의 범주로 구분할 수 있다.

 1) benign neoplasms : 양성 종양

 2) in situ neoplasms : 상피 내암

 3) malignant neoplasms : 악성 종양

 4) neoplasms of uncertain or unknown behavior : 

암종과 육종

- 악성종양은 발생 부위에 따라 암종(Carcinoma)와 육종(Sarcoma)로 나뉜다.

- 암종은 점막, 피부 같은 상피성 세포에서 발생한 악성종양을 뜻하고 육종은 근육, 결합조직, 뼈, 연골, 혈관 등의 비상피성 세포에서 발생한 악성종양을 뜻한다.

- carcinoma는 기원한 세포에 따라 아래처럼 나눌 수 있다. (예시 외에도 존재하지만 드물게 나타남으로 생략한다.)

 1) Adenocarcinoma : 선암종

   점액 등 피복원주상피, 선상피 세포로부터 발생한다.

 2) Squamous cell carcinoa : 편평세포암종

  중층편평상피세포를 가진 피부, 구강, 인두, 식도, 질, 자궁질부 등의 점막에서 발생한다.

 3) Adenosquamous carcinoma : 선편평세포암종

 4) Large cell carcinoma : 대세포암종

 5) Small cell carcinoma : 소세포암종

더 자세히 알고 싶으면 oncotree 사이트에 32개의 sample에 따른 685개의 암 종류를 확인할 수 있다.

고형암과 혈액암

- 고형암은 암 세포가 자라면서 덩어리를 이루는 암을 말한다. 간암, 폐암, 유방암, 위암 등 대부분의 암들이 여기에 해당하며 치료를 위해서는 해당 부위를 절제 후 항암, 방사선 치료 등을 시행한다.

- 혈액암은 혈액이나 조혈기관, 림프절, 림프 기관 등 혈액을 구성하는 성분에 발생한 암을 말한다. 백혈병, 악성림프종, 다발성골수증 등이 여기에 해당하며 전체 암의 약 5~10%정도의 비율을 차지한다.

Reference -

http://oncotree.mskcc.org/#/home

CancerSCAN

LabGenomics에서 SGI로부터 기술이전을 받아 서비스 하고 있는 Cancer Scan의 method에 관한 리뷰이다.

Cancer Scan (Cancer Somatic mutation call for Clinical reports with ANnotation)의 궁극적인 목적은 암환자의 종양 샘플에서 주요 유전자의 변이를 검출하여 맞춤형 치료를 가능하도록 하는 것이다.

잘 알려진 pathogenic gene 381개를 타겟하는 패널을 제작하여 mean 800x 이상을 sequencing하고 여기에 SNVs, INDELs, Fusion gene, CNV를 찾아내는 tools을 사용한다.

사용하는 tool로는 Mutect, LoFreq, pindel과 local script를 사용한다.

파이프라인은 tumor purity, treatment-induced mutation 등으로 발생한 low variant allele frequency도 잘 찾아낼 수 있으며 약 800X의 depth를 생산하여 FFPE등의 정제도가 떨어지는 검체에서도 높은 sensitivity를 가진다는 것이 장점이다.

실제 clinical samples에서는 tumor purity가 매우 낮기 때문에 이러한 low-variant allele frequency를 가지는 변이를 찾아내는것이 매우 중요하다.

이미 7,000명 이상의 한국인 환자의 데이터 분석을 통해 한국인에게 맞는 분석 데이터 베이스를 확보하였으며 지속적인 Annotation 데이터베이스 업데이트로 질병 변이가 일어난 유전자에 따른 최신의 표적 항암제 정보도 제공하고 있다. 

Reference -

Hyun-Tae Shin et al, Prevalence and detection of low-allele-fraction variants in clinical cancer samples, NatureCommunications, 2017

DOI: 10.1038/s41467-017-01470-y