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python multi-level argparse

parser = argparse.ArgumentParser()

subparser = parser.add_subparsers(help='Desired action to perform', dest='action')

parent_parser = argparse.ArgumentParser(add_help=False)

parser_ReDemulti = subparser.add_parser("ReDemulti", parents=[parent_parser], help='Re Demultiplexing')
parser_ReDemulti.add_argument("RunID", help='Only require one run ID which have Samplesheet_gpcd.csv')

parser_MultiAnal = subparser.add_parser("MultiAnal", parents=[parent_parser], help='Multiple Analysis from One Customer')
parser_MultiAnal.add_argument("SampleFile", help='A file with one sample ID per line')

parser_NoData = subparser.add_parser("NoDataSamples", parents=[parent_parser], help='Re Run No-Data Samples')
parser_NoData.add_argument("SampleFile", help='A file with one sample ID per line')

parser_RunFastQC = subparser.add_parser("RunFastQC", parents=[parent_parser], help='Run from FastQC Step')
parser_RunFastQC.add_argument("SampleID", help='Only require one sample ID')

parser_RmDenovo = subparser.add_parser("RmDenovoFiles", parents=[parent_parser], help='Remove Database Files in denovo01')
parser_RmDenovo.add_argument("SampleID", help='Only require one sample ID')

args = parser.parse_args()

python 파일 입출력

python에서 파일을 찾고, 파일이 없을시 except 출력, 있다면 파일을 열어서 본문을 수행하고 파일 닫고 종료.

        try : 
                list_file = open(list_file_name) 

        except OSError : 
                print('can\'t find '+list_file_name) 

        else : 
                with listfile : 
                        for line in listfile :
                        	# do somthing

Illumina 시퀀싱에서 약 10-12개의 염기가 균등하게 분포하지 않는 패턴을 보인다. gDNA에서는 조금 더 드물지만 mRNA-seq에서는 대부분의 데이터가 이러한 패턴을 보이는데 이유를 찾아보았다.

Illumina에서는 이러한 현상의 원인을 랜덤프라이머를 제작하여 시퀀싱을 진행하지만 랜덤 프라이머가 완전한 랜덤이 아니기때문이라고 얘기한다.  

아래 plot은 bisulfite-seq 이다. bisulfite 처리로 인해 CtoT 변화로 C의 비율은 낮고 T의 비율이 높게 나온다. 하지만 그와 별도로 여전히 10개의 염기의 비율이 특이적이다.

해당 부분은 분석에 크게 영향을 주지 않으니 무시하고 진행하여도 상관없다.

Reference -

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=11843

http://nar.oxfordjournals.org/content/38/12/e131

DNA methylation은 DNA 염기 서열의 변화 없이 변화를 일으킨다. 유전자 프로모터에 위치할 때 전사를 억제하는 방향으로 작용할 때가 많으며 포유류에서의 DNA 메틸화는 정상적으로 발달할 수 있게 하는 핵심 역할을 하며 그 외에도 genomic imprinting, X-chromosome inactivation, repression of transposable elements, aging, and carcinogenesis등에 관여하는것으로 알려져 있다.

Cytosine과 adenine이 메틸화 될 수 있으며 adenine의 경우 박테리아나 식물에서 그리고 드물게 포유류에서 관찰되지만 비율이 적어 많이 연구되지는 않았으며 cytosine에는 eukaryotes와 prokaryotes 모두에서 빈번히 일어난다.

식물이나 다른 유기체에서 DNA 메틸화는 CpG, CHG or CHH (Hsms A,T 또는 C)상황에서 일어난다. 그러나 포유류에서는 대부분 CpG에서 발견된다. Non-CpG 메틸화는 배아 줄기세포에서 발견되거나 신경 발달과정에서 확인할 수 있다. 그러나 최근에는 Non-CpG 메틸화가 질병과 연관이 있을 수 있다는 연구보고가 있어 중요도가 올라가고 있다.

Reference -

https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_methylation

Pyrosequencing, methylation-specific polymerase chain reaction (PCR), direct Sanger sequencing이 프로모터 영역이나 CpG island 등 특정 영역의 메틸화 정도를 보려고 할 때 사용하는 기술이다. 이 기술들은 유용하지만 정확도가 낮고 read length가 짧으며 수율이 낮다는 단점이 있다.

이후에 적은 비용과 많은 양의 DNA가 필요하지 않으면서도 게놈 영역 전체를 커버할 수 있는 Microarray를 사용한 기술을 사용한 메틸화 분석 기술이 나왔으나 이는 depth에 의해 결과가 영향을 받을 수 있다.

NGS기술은 단일 염기 수준의 정확도로 거의 모든 CpG 사이트를 구분할 수 있는 기술임을 보였으나 여전히 density-biased, deficient in robustness and consistency, or incapable of analyzing 5mC specifically 등의 문제가 있다.

가장 많이 사용하는 기술의 요약이다.

1. Affinity Enrichment-Based Methods

antibody(MeDIP-Seq)나 binding protein(MBD-Seq)을 사용하는 방법으로 특정 영역을 당겨서 시퀀싱을 하고 나머지는 버리는 방법이다. enriched CpG영역에 대한 분석에 용이하다.

2. Restriction Enzymes-Based Methods

MspI 제한효소를 하용하여 CCGG motifs를 절단한다. 시간과 비용이 적게 들고 DNA도 소량만 있으면 되지만 게놈 영역 전체를 골고루 커버할 수 없다. (특정 영역이 chromatin structure 등에 의해 더 잘 잘리거나, 덜 잘리거나 하는 경향이 있을 수 있음.)

3. Bisulfite Conversion-Based Methods

bisulfite 처리를 하면 보통의 C가 U라 바뀌지만 메틸화 C는 바뀌지 않는다. 따라서 bisulfite처리를 한 샘플과 게놈 sequence를 비교하여 실제 메틸화 C가 어디 있는지를 알아낼 수 있으며 따라서 이 분석에 맞는 alignment프로그램을 사용하여야 한다. 가장 많이 쓰이는 프로그램은 BISMARK.

WGBS는 가장 많은 정보를 담을 수 있지만 비싸다는 단점이 있다.

4. Oxidative Bisulfite Conversion-Based Methods

최근에 개발된 기술로 5hmC와 5caC, 5fC를 포함하여 cytosine modification을 찾아낼 수 있다. 방법으로는 Ox-BS나 TAB-Seq 등이 있다.

5. Capture-Based Methods

기존의 방법들에 비해 많은 진보가 있는 기술로서 whole genome sequencing에 비해 cost-effective 하면서도 수율도 높고 특히나 complex regions에서 강점을 보인다.  MethylCap-seq은 CpG islands 외의 질병과 관련되어있는 메틸화 영역에 대한 연구가 가능하며 reproducibility도 높음을 여러 샘플에서 보여주었다. MethylCap-seq 외에도 SeqCap Epi CpGiant 등 bisulfite-converted DNA를 사용하여 방법들이 있다. 

6. Third-Generation Sequencing

최근에는 chemical conversion이 없이도 DNA modification 분석이 가능한 기술이 가능하다. SMRT DNA sequencing은 kinetics of DNA polymerase를 인지함으로 modifed DNA를 찾아낼 수 있다. nanopore sequencer또한 DNA base의 modification 여부를 reading과정 중에 찾아낼 수 있다.

참고 -

Barros-Silva, Daniela et al. “Profiling DNA Methylation Based on Next-Generation Sequencing Approaches: New Insights and Clinical Applications.” Genes vol. 9,9 429. 23 Aug. 2018, doi:10.3390/genes9090429