SRA data 다운로드받기

NCBI에서 SRA data를 받을 수 있는 방법은 세 가지 이다.

1. SRA Toolkit

NCBI SRA 다운로드 페이지 :

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/toolkitsoft/

압축을 풀면 바로 bin폴더가 생성되어 있고 이 중에 fastq-dump를 사용하여 받을 수 있다.

사용법은 

fastq-dump -A [accession number]

2. ascp utility

aspera 홈페이지 :

https://downloads.asperasoft.com/en/downloads/50

sh 파일을 다운르도 후 root로 진행하면 된다. (보류)

3. wget

ascp가 고속 전송을 지원하기 때문에 FTP를 사용하는 것 보다 10배는 빠르지만 별도의 설치나 key파일을 필요로 하기 때문에 초기 셋팅이 번거롭다.

wget은 가장 간단하게 사용할 수 있지만 속도가 느리다.

wget /sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/{SRR|ERR|DRR}/<first 6 characters of accession>/<accession>/<accession>.sra

wget ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR304/SRR304976/SRR304976.sra

아래의 bash script를 만들고 "sh sradownload.sh SRR304976" 라고 입력하면 sra를 다운받아서 fastq까지 만들어준다.

wget ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/${1:0:3}/${1:0:6}/${1}/${1}.sra

fastq-dump --split-3 ${1}.sra

Reference -

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/toolkitsoft/

somatic mutation과 germline mutation

somatic mutation(체세포 돌연변이)과 germline mutation(생식세포 돌연변이)의 개념이 가장 많이 등장하는 곳은 암 유전체일 것이다. 

두 돌연변이 모두 DNA 서열상에서의 돌연변이를 가리키며 각각의 개념의 정의는 아래와 같다.

체세포 돌연변이 - 체세포에서 돌연변이가 발생. 몸 전체에서 일부 영역의 세포만이 돌연변이를 갖는다. 

생식세포 돌연변이 - 생식세포 돌연변이는 부모 세대로부터 물려받은, 배아가 형성될 때부터 이미 가지고 있는 돌연변이로서 몸 전체 어느 세포든지 같은 돌연변이를 갖는다.

두 돌연변이가 암 유전체에서 많이 등장하는 이유와 구분하는 방법은 무엇일까

대부분 암은 체세포 돌연변이로 발생한다. 사람이 살아가는 동안 ROS, UV 등으로 DNA가 계속 변이의 위험에 노출되는데 이때 세포 성장이나 세포 주기에 관여하는 유전자에 돌연변이가 생기면 암세포로 변이되는 것이 가장 일반적인 암 발생 패턴이다. 그런데 이러한 유전자에 생식세포 때부터 돌연변이가 있다면 애초에 사산될 확률이 높기 때문이다.

따라서 암 치료 시 환자 개개인의 암세포를 채취해서 생식세포 돌연변이보다는 체새포 돌연변이를 찾아내고 해당 변이에 맞는 약물을 투여하는 것이 개인 맞춤형 치료이다.

물론 BRCA 돌연변이같이 유전되는 생식세포 돌연변이도 존재한다. 이러한 암을 대략 5~20% 정도로 예상하고 있다.

두 돌연변이를 구분할 수 있는 가장 확실한 방법은 N-T pair 비교이다.

환자의 정상 세포와 암세포를 각각 채취하여 GATK에서 제공하는 Mutact2 또는 이 같은 목적의 프로그램을 돌리는 것이다.

이론적으로 염색체의 염기 서열은 Homozygous인지 Heterozygous인지에 따라 0%, 50%, 100%를 가지게 된다. 

ex) G/G or G/T or T/T 이런식으로 maternal, paternal을 가진다. 

하지만 체세포 변이가 일어나면 그 비율이 달라질 수 있다. 특정 염색체에서만 변이가 일어나거나 CNV 등이 일어나서 염기 비율이 달라진 세포와 일반적인 세포가 섞여있기 때문이다. 10개의 세포중에 7개의 정상세포가 T/T를 가지고 있었고 3개가 암세포이고 G/T로 변이되었다고 하자. G/T의 비율은 3/17가 된다. 

프로그램은 정상 세포에서 발견한 돌연변이와 암세포에서 발견한 돌연변이를 고려하여 체세포 돌연변이로 구분하게 된다.

Whole genome sequencing을 사용하여 염색체 전체에서 수행하는 것이 가장 확실하지만, 비용과 시간의 문제로 인해 Whole exome sequencing으로도 많이 진행하고 있으며 RNA-seq으로도 진행할 수 있지만 신뢰도가 그리 높지는 않다. 신뢰도가 높지 않은 이유는 RNA는 기본적으로 불안전 할 뿐만 아니라 RNA editing등으로 서열이 쉽게 변하고 이것이 변이라고 분석되어 질 수 있기 때문이다.

Reference -

http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/33-meiosis/somatic-vs-germline-mutatio.html

oncotator 설치 및 실행하기

oncotator는 암 연구에서 point mutations이나 indels이 기능적으로 연관성이 있는지를 annotation 해주는 프로그램이다. COSMIC, Tumorscape, MutSig 결과를 조합하여 암 특이적 annotation을 해준다.

설치에 앞서 oncotator는 python 모듈인데 아래처럼 특정 버전의 모듈이 필요다. 

oncotator용 python-2.7.15를 새로 설치하였다. 

2017/08/16 - [programming language/python] - Python 설치 및 실행하기

oncotator 다운로드 페이지는 gatk에서 확인할 수 있다.

https://gatkforums.broadinstitute.org/gatk/discussion/4154/howto-install-and-run-oncotator-for-the-first-time#latest

oncotator와 data source를 모두 받는 것을 권장한다.

python은 pip까지 설치. oncotator는 압축만 풀고 난 뒤 설치를 진행하였다.

아래와 같은 메시지가 떴다. mac이 아닌 환경에서는 직접 설치를 해줘야 한단다.

위의 메시지와 똑같이 입력하였다.

다시 빌드하였을 때 위와 같은 메시지가 없어진 것을 확인하였고 그대로 설치하였다.

install 과정에서 아래와 같은 에러 발생.

검색해보니 Numpy install 오류라고 한다. (https://github.com/andersbll/cudarray/issues/34)

oncotator를 install할 때 모듈을 설치하기는 하는데 미리 메뉴얼로 설치하는게 혹시 모를 오류가 안생기는듯 하다.

근데 pysam 설치하다가 또 오류남.

Reference -

https://github.com/abishara/athena_meta/issues/1

tar 디렉토리 지정해서 압축 풀기

원하는 경로에 압축을 풀고싶다면 아래처럼 입력하면 된다.

해당 폴더에 파일을 바로 압축을 풀어주니 미리 빈 폴더를 생성하고 그 폴더 안에 푸는것이 좋을 것 같다.

liftover하기

liftover란?

- 다른 genome에 맞게 결과 파일의 버전을 바꾸는 것을 말한다. 

- 사람의 genome은 hg19, GRCh37, GRCh38 등 여러 개가 존재하며 이에 따라 각 유전자의 위치도 조금씩 차이가 난다. 새롭게 genome을 만들 때마다 모든 정보를 새로 작성하는 것 보다 기존의 정보에서 달라진 위치만 수정하는 것이 비용이나 시간상으로 효율적일 것이다.

- 권장하지는 않지만 다른 종의 genome 간의 비교도 가능하다. 단 여기서는 서열 간의 차이가 크게 나기 때문에 정확도가 낮아 손실되는 정보가 있을 수 있음에 유의해야 한다.

CrossMap

liftover를 지원하는 프로그램은 여러 개 있지만, 여기에선 CrossMap을 소개하고자 한다.

CrossMap은 SAM/BAM, Wiggle/BigWig, BED, GFF/GTF, VCF 등 다양한 포맷의 파일을 지원하며 특히나 python module이기 때문에 설치가 매우 간단하다.

아래와 같이 입력하면 설치가 완료된다.

Python 2.7 이하에서만 작동하는 모듈이다.

dependency가 있지만, 특별히 어려운 모듈은 없어서 pip에서 알아서 설치해주니 크게 신경 쓸 필요는 없다.

설치가 제대로 되었으면 chain 파일이 필요하다.

chain 파일이란 두 genome 간의 변화된 부분이 작성된 파일이다. CrossMap 홈페이지에서 사람과 쥐의 chain 파일을 제공하고 있으며 USCS genome browser에 가면 종간의 chain 파일도 내려받을 수 있다.

CrossMap 홈페이지 : http://crossmap.sourceforge.net/

프로그램 사용법은 홈페이지에 자세하게 나와 있으니 요약하기만 하겠다.

input file이 hg18이고 output file이 hg19라면 chain file은 hg18Tohg19를 넣으면 된다.

Reference -

http://crossmap.sourceforge.net/