Pyrosequencing, methylation-specific polymerase chain reaction (PCR), direct Sanger sequencing이 프로모터 영역이나 CpG island 등 특정 영역의 메틸화 정도를 보려고 할 때 사용하는 기술이다. 이 기술들은 유용하지만 정확도가 낮고 read length가 짧으며 수율이 낮다는 단점이 있다.
이후에 적은 비용과 많은 양의 DNA가 필요하지 않으면서도 게놈 영역 전체를 커버할 수 있는 Microarray를 사용한 기술을 사용한 메틸화 분석 기술이 나왔으나 이는 depth에 의해 결과가 영향을 받을 수 있다.
NGS기술은 단일 염기 수준의 정확도로 거의 모든 CpG 사이트를 구분할 수 있는 기술임을 보였으나 여전히 density-biased, deficient in robustness and consistency, or incapable of analyzing 5mC specifically 등의 문제가 있다.
가장 많이 사용하는 기술의 요약이다.
1. Affinity Enrichment-Based Methods
antibody(MeDIP-Seq)나 binding protein(MBD-Seq)을 사용하는 방법으로 특정 영역을 당겨서 시퀀싱을 하고 나머지는 버리는 방법이다. enriched CpG영역에 대한 분석에 용이하다.
2. Restriction Enzymes-Based Methods
MspI 제한효소를 하용하여 CCGG motifs를 절단한다. 시간과 비용이 적게 들고 DNA도 소량만 있으면 되지만 게놈 영역 전체를 골고루 커버할 수 없다. (특정 영역이 chromatin structure 등에 의해 더 잘 잘리거나, 덜 잘리거나 하는 경향이 있을 수 있음.)
3. Bisulfite Conversion-Based Methods
bisulfite 처리를 하면 보통의 C가 U라 바뀌지만 메틸화 C는 바뀌지 않는다. 따라서 bisulfite처리를 한 샘플과 게놈 sequence를 비교하여 실제 메틸화 C가 어디 있는지를 알아낼 수 있으며 따라서 이 분석에 맞는 alignment프로그램을 사용하여야 한다. 가장 많이 쓰이는 프로그램은 BISMARK.
WGBS는 가장 많은 정보를 담을 수 있지만 비싸다는 단점이 있다.
4. Oxidative Bisulfite Conversion-Based Methods
최근에 개발된 기술로 5hmC와 5caC, 5fC를 포함하여 cytosine modification을 찾아낼 수 있다. 방법으로는 Ox-BS나 TAB-Seq 등이 있다.
5. Capture-Based Methods
기존의 방법들에 비해 많은 진보가 있는 기술로서 whole genome sequencing에 비해 cost-effective 하면서도 수율도 높고 특히나 complex regions에서 강점을 보인다. MethylCap-seq은 CpG islands 외의 질병과 관련되어있는 메틸화 영역에 대한 연구가 가능하며 reproducibility도 높음을 여러 샘플에서 보여주었다. MethylCap-seq 외에도 SeqCap Epi CpGiant 등 bisulfite-converted DNA를 사용하여 방법들이 있다.
6. Third-Generation Sequencing
최근에는 chemical conversion이 없이도 DNA modification 분석이 가능한 기술이 가능하다. SMRT DNA sequencing은 kinetics of DNA polymerase를 인지함으로 modifed DNA를 찾아낼 수 있다. nanopore sequencer또한 DNA base의 modification 여부를 reading과정 중에 찾아낼 수 있다.
참고 -
Barros-Silva, Daniela et al. “Profiling DNA Methylation Based on Next-Generation Sequencing Approaches: New Insights and Clinical Applications.” Genes vol. 9,9 429. 23 Aug. 2018, doi:10.3390/genes9090429
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