RNA-seq 라이브러리 종류와 구별법

Susan M. Corely et al., Differentially expressed genes from RNA-Seq and functional enrichment results are affected by the choice of single-end versus paired-end reads and stranded versus non-stranded protocols, BMC Genomics, 2016

Single-end 

- single-end는 우리가 생각할 수 있는 가장 기본적인 형태이다. 단순히 길이가 약 35~150bp 정도가 되는 단일 reads들의 집합으로 존재하며 수 년 전에 생산한 데이터들은 이 형태를 많이 띄고있다. 다른 방법들에 비해 만들기 쉽지만 상대적으로 정확한 위치에 맵핑되지 않는다는 단점이 있기 때문에 Illumina사의 HiSeq등의 기술로 생산하는 short reads에서는 많이 보이지 않는 추세이다.

- 하지만 PacBio, Minion, MiSeq등의 기술은 reads의 길이를 350~수 kb에 해당하게 늘릴 수 있고 길이가 긴 reads는 정확환 위치에 맵핑할 확률이 늘어나기 때문에 특정한 상황에서는 여전히 쓰이고 있다.

Paired-end

- paired-end는 초기 single-end의 단점을 극복하고자 read를 양 쪽에서 읽어 한 쌍의 fragement를 만들어 더 정확한 위치에 맵핑되고자 하는 방식이다. 

Zhernakova, et al., PLoS Genet. 2013

- 위의 사진을 비교해보면 길이가 100bp reads가 있다고 가정할 때, single-end에서는 전체 genome상에 reads와 유사한 서열이 100bp만 있다면 그 곳에 맵핑 될 수 있지만 paired-end같은 경우에는 한 쌍이라서 100bp+약간의 간격+100bp가 모두 일치해야만 되기 때문에 200bp+@가 매치되어야한다. 이는 확률적으로 잘못된 위치에 맵핑될 확률이 single-end보다 낮아진다는 것을 의미한다. (@는 insert size를 말하며 라이브러리 제작시 원하는 만큼 줄 수 있다.)

Single-end와 Paired-end 구별법

- single-end와 paired-end의 구분법은 대부분의 paired-end는 왼쪽과 오른쪽 파일이 각각 존재한다. sample_1.fq와 sample_2.fq가 있다면 각 파일 안에 있는 readID가 같은 것 끼리 짝을 이루는 식이다. 한 파일 양 reads가 동시에 존재하는 경우도 있는데 이때도 파일 안에 readID를 자세히 보면 readID가 동일하고 끝에 1/2 이런식으로 구분되어 있다면 paired-end인 것이다.

Unstranded

- 라이브러리를 제작할 때 시퀀싱 기계가 reads를 읽기 위해서 양 말단에 adapter sequence를 붙이게 되는데 같은 서열의 adapter sequence가 붙게 되면 reads의 앞 뒤를 구분할 수 없게 된다. 

Strand-specific

- Strand-specific은 양 말단의 adapter sequence를 다르게 붙임으로써 reads의 앞 뒤를 구분해 주는 방식을 말하는데, 제작방식은 크게 세 가지가 존재하며, 각 방식에따라 맵핑할 때 옵션을 다르게 줘야 할 수도 있으니 구분할 수 있는것이 좋다.

- 맵핑 프로그램을 보면 fr-strand, rf-strand 등이 존재하는데 앞의 fr은 foward reverse, rf는 reverse foward를 의미하며 각각 앞 뒤의 reads가 정방향인지 역방향인지를 의미한다. 어떤 것을 선택할 지는 paired-end 제작 방식에 따라 달라질 수 있기 때문에 지정해주어야한다. (STAR는 프로그램이 알아서 계산하지만 tophat은 직접 넣어줘야 한다. 아래는 tophat의 메뉴얼중의 일부로 옵션별 설명이 있어서 캡쳐해서 가져와 보았다.)

- 아래는 strand 예측이 왜 중요한지를 보여주는 figure이다. 가끔 genome 상에서 유전자들이 겹치는 부분이 존재한다. (DNA상에서의 방향성이 같고 겹친다면 같은 유전자이기 때문에 당연히도 예시의 두 유전자의 방향성은 반대이다.) Unstranded RNA-seq signal을 보면 어떤 유전자에서 나온 reads인지 구분이 안되지만 stranded RNA-seq이라면 RPD signal처럼 구분할 수 있다. 또한 발현량 분석 프로그램이 유전자의 방향성과 반대의 방향성을 가진 reads들은 유전자의 발현량으로 계산하지 않는 다는 점에서 strand-specific은 더 정확한 유전자 발현량을 계산할 수 있게 해주는 방식이라고 말할 수 있다.

(해당 논문은 unstrand데이터를 stranded데이터로 바꾸는 프로그램을 소개하며 해당 방식을 적용했을 때 민감도와 특이도가 높아지는 것을 보여준다.)

Bo-Hyun You et al., High-confidence coding and noncoding trnascriptome maps, Genome Research, 2017

Unstranded와 Strand-specific 구별법

- 아래 그림을 보면 방향성이 <<< 인 유전자에 있는 reads는 대부분 F1R2를 가지고 있고 >>>에는 F2R1를 가지고 있는 것을 확인할 수 있다. (가끔 by chance로 아닌 reads들이 있지만 5% 미만이다.)

위의 방식을 지원하는 프로그램도 존재한다.

2018/08/06 - [bioinformatics] - RSeQC를 사용하여 stranded 데이터 확인하기

마지막으로 Single-end, Paired-end와 Stranded, Unstranded는 별개의 개념이라는 것을 알아야 한다. Single-end이더라도 Stranded일 수도 있고 Unstranded일 수도 있으며 Paired-end도 마찬가지이다.

Reference -

https://genome.cshlp.org/content/27/6/1050.full?sid=63335fd5-50fe-46bd-b849-c88bbc2a0a84

https://www.biostars.org/p/70833/#70834

http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1003594